ઉચ્ચ-પ્રદર્શન પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફી (HPLC) દ્વારા ફળો અને શાકભાજીમાં ઓક્સાલિક એસિડની સામગ્રીનું નિર્ધારણ

નું નિર્ધારણ ઓક્સાલિક એસિડ ઉચ્ચ-પ્રદર્શન પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફી (HPLC) દ્વારા ફળો અને શાકભાજીમાં સામગ્રી
૧. પ્રાયોગિક સિદ્ધાંત અને પદ્ધતિ ડિઝાઇન
ફળો અને શાકભાજીમાં સામાન્ય કાર્બનિક એસિડ તરીકે, ઓક્સાલિક એસિડનું પ્રમાણ ખોરાકના સ્વાદ અને પોષણ મૂલ્યને સીધી અસર કરે છે. આ પ્રયોગ રિવર્સ્ડ-ફેઝ હાઇ-પર્ફોર્મન્સ લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી (RP-HPLC) નો ઉપયોગ કરે છે. એસિડિક મોબાઇલ ફેઝ પરિસ્થિતિઓમાં, ઓક્સાલિક એસિડને C18 ક્રોમેટોગ્રાફિક કોલમનો ઉપયોગ કરીને દખલ કરતા પદાર્થોથી બેઝલાઇન-અલગ કરવામાં આવે છે. ઓક્સાલિક એસિડ પરમાણુઓમાં કાર્બોક્સિલ જૂથોની યુવી શોષણ લાક્ષણિકતાઓના આધારે, માત્રાત્મક વિશ્લેષણ માટે 210 nm પર સેટ કરેલ અલ્ટ્રાવાયોલેટ ડિટેક્ટરનો ઉપયોગ થાય છે.
2. માનક વળાંક અને નમૂના તૈયારી
પ્રમાણભૂત દ્રાવણ તૈયાર કરવા માટે ગ્રેડિયન્ટ ડિલ્યુશન પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે: 25.0 મિલિગ્રામ ઓક્સાલિક એસિડ ડાયહાઇડ્રેટનું સચોટ વજન કરો અને 1 મિલિગ્રામ/મિલી સ્ટોક દ્રાવણ મેળવવા માટે તેને અતિ શુદ્ધ પાણીથી 25 મિલી સુધી પાતળું કરો. આને ક્રમિક રીતે 50, 100, 200, 400 અને 800 µg/મિલી પર પ્રમાણભૂત દ્રાવણની શ્રેણીમાં પાતળું કરવામાં આવે છે, દરેક સાંદ્રતા ત્રિપુટીમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવે છે.
નમૂના તૈયાર કરવા માટે, માઇક્રોવેવ-સહાયિત નિષ્કર્ષણનો ઉપયોગ થાય છે: 5.00 ગ્રામ ફળ/શાકભાજી હોમોજેનેટનું વજન કરો, 0.1 મોલ/લિટર હાઇડ્રોક્લોરિક એસિડ દ્રાવણનું 10 મિલી ઉમેરો, 60°C પર માઇક્રોવેવથી 10 મિનિટ માટે ટ્રીટ કરો, 0.45 µm મેમ્બ્રેન ફિલ્ટર દ્વારા ફિલ્ટર કરો, અને પરીક્ષણ માટે ફિલ્ટરેટ એકત્રિત કરો.
3. ક્રોમેટોગ્રાફિક સ્થિતિઓનું ઑપ્ટિમાઇઝેશન
મોબાઇલ ફેઝ એ 0.01 mol/L પોટેશિયમ ડાયહાઇડ્રોજન ફોસ્ફેટ બફર (pH 2.5)-એસેટોનિટ્રાઇલ (95:5) સિસ્ટમ છે, જેનો પ્રવાહ દર 0.8 mL/મિનિટ અને સ્તંભ તાપમાન 35°C છે. એસેટોનિટ્રાઇલ પ્રમાણને સમાયોજિત કરવાથી જાણવા મળે છે કે જ્યારે કાર્બનિક ફેઝ 10% થી વધુ હોય છે, ત્યારે ઓક્સાલિક એસિડનો રીટેન્શન સમય 3 મિનિટથી ઓછો થઈ જાય છે, પરંતુ પીક ટેઇલિંગ થાય છે. અંતિમ ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ પરિસ્થિતિઓ હેઠળ, ઓક્સાલિક એસિડનો રીટેન્શન સમય 4.2 મિનિટ છે, જે નજીકના સાઇટ્રિક એસિડ અને મેલિક એસિડ (રિઝોલ્યુશન > 1.5) થી સંપૂર્ણ અલગતા પ્રાપ્ત કરે છે.
4. પદ્ધતિ માન્યતા
રેખીય શ્રેણી ચકાસણી 10-1000 µg/mL (R² = 0.9993) ની રેન્જમાં પીક એરિયા અને સાંદ્રતા વચ્ચે સારો રેખીય સંબંધ દર્શાવે છે. સિગ્નલ-ટુ-નોઈઝ રેશિયો પદ્ધતિ દ્વારા નક્કી કરાયેલ શોધ મર્યાદા (LOD) 0.5 µg/mL છે. પુનરાવર્તિતતા પરીક્ષણોમાં, સમાન સ્પિનચ નમૂનાના છ પ્રતિકૃતિ નિર્ધારણ માટે RSD 1.8% છે. ત્રણ સ્તરો (80%, 100% અને 120%) પર સ્પાઇક પુનઃપ્રાપ્તિ પ્રયોગો અનુક્રમે 98.2%, 102.4% અને 97.8% ની સરેરાશ પુનઃપ્રાપ્તિ આપે છે, જે માત્રાત્મક વિશ્લેષણ માટેની આવશ્યકતાઓને પૂર્ણ કરે છે.
5. વાસ્તવિક નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ
છ વ્યાપારી રીતે ઉપલબ્ધ ફળો અને શાકભાજીનું પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું: પાલક (356 ± 12 મિલિગ્રામ/100 ગ્રામ), સેલરી (215 ± 9 મિલિગ્રામ/100 ગ્રામ), ટામેટા (18 ± 2 મિલિગ્રામ/100 ગ્રામ), સફરજન (6 ± 1 મિલિગ્રામ/100 ગ્રામ), કેળા (શોધાયું નથી), અને બ્રોકોલી (89 ± 5 મિલિગ્રામ/100 ગ્રામ). રાષ્ટ્રીય માનક પદ્ધતિ (GB 5009.277-2016) સાથે સરખામણી દર્શાવે છે કે બે પદ્ધતિઓ વચ્ચે સંબંધિત વિચલન 5% કરતા ઓછું છે, જે આ પદ્ધતિની વિશ્વસનીયતા ચકાસે છે. ખાસ કરીને, ઓછી સામગ્રીવાળા નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરતી વખતે HPLC પદ્ધતિ પરંપરાગત ટાઇટ્રેશન પદ્ધતિઓ કરતાં વધુ સંવેદનશીલતા દર્શાવે છે.
6. મુખ્ય નોંધો
નમૂના પ્રીટ્રીટમેન્ટ દરમિયાન pH મૂલ્યને સખત રીતે નિયંત્રિત કરો. જો અર્કનો pH 3 થી વધુ હોય, તો કેલ્શિયમ ઓક્સાલેટ અવક્ષેપન ઓછા પરીક્ષણ પરિણામો તરફ દોરી જશે. મીઠાના અવક્ષેપ અને સ્તંભ અવરોધને ટાળવા માટે મોબાઇલ ફેઝ દરરોજ તાજું તૈયાર કરવું જોઈએ. દર 20 ઇન્જેક્શન પછી, સ્તંભ કાર્યક્ષમતામાં ઘટાડો અટકાવવા માટે 30 મિનિટ માટે એસિટોનાઇટ્રાઇલ-પાણી (30:70) થી સ્તંભને ફ્લશ કરો. રંગદ્રવ્ય ધરાવતા નમૂનાઓ (દા.ત., જાંબલી કોબી) માટે, ઇન્જેક્શન પહેલાં ઘન-તબક્કા નિષ્કર્ષણ શુદ્ધિકરણ પગલું ઉમેરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.
૭. એપ્લિકેશન અને વિસ્તરણ દિશાનિર્દેશો
આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ પેશાબ અને લોહી જેવા જૈવિક નમૂનાઓમાં ઓક્સાલિક એસિડની શોધ સુધી કરી શકાય છે. મોબાઇલ ફેઝ કમ્પોઝિશનને સમાયોજિત કરીને (દા.ત., ટેટ્રાબ્યુટીલેમોનિયમ હાઇડ્રોક્સાઇડ ઉમેરીને), ઓક્સાલિક એસિડ અને તેના મેટાબોલાઇટ્સ એકસાથે નક્કી કરી શકાય છે. માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી ડિટેક્ટર સાથે જોડીને, વધુ ચોક્કસ ટ્રેસ શોધ પદ્ધતિ સ્થાપિત કરી શકાય છે. ફૂડ પ્રોસેસિંગ ઉદ્યોગમાં, આ પદ્ધતિ ઓછી-ઓક્સાલિક એસિડ જાતોની પસંદગી અને રસોઈ પ્રક્રિયાઓના ઑપ્ટિમાઇઝેશન માટે મહત્વપૂર્ણ ડેટા સપોર્ટ પ્રદાન કરી શકે છે.